Josefine Preuß spielte als Kind in der Potsdamer Theatergruppe Taifun und einige Kinderhauptrollen am Hans Otto Theater in Potsdam. Von 2000 bis 2003 war Preuß in der KinderserieSchloss Einstein, die im KI.KA ausgestrahlt wird, als intrigant-zickige Anna Reichenbach zu sehen. Ihr Charakter entwickelte sich zu einer tragenden Rolle und machte sie populär. Im Februar 2006 kehrte sie für einige Folgen zurück. Später folgten diverse kleinere (unter anderem in Inspektor Rolle), aber auch größere (Jargo) Rollen. 2004 übernahm sie die Moderation des Kinderkanal-Journals Quergelesen, in dem sie Bücher für Kinder und Jugendliche vorstellte. Im selben Jahr spielte sie die Rolle der Nessie im ProSieben-Spielfilm Klassenfahrt – Geknutscht wird immer.

2005 verkörperte sie die Sophie in der ProSieben-Teeniekomödie Schüleraustausch – Die Französinnen kommen. Nach dem Abbruch der Schule besuchte Preuß die privateSchauspielschule Die Etage in Berlin, brach diese im letzten Semester ab und drehte im Anschluss den Film Küss mich, Genosse!, in dem sie die Alexandra spielt. Im Herbst 2005 stand sie in Berlin für die erste Staffel der ARD-Vorabendserie Türkisch für Anfänger vor der Kamera. Nach Drehschluss der zweiten Staffel von Türkisch für Anfänger drehte sie in Prag fürDornröschen - Ab durch die Hecke, eine Episode aus der ProSieben Märchenstunde. Sie spielt darin die Hauptrolle. 2007 spielte sie die Hauptrolle in dem anspruchsvollen Kurzfilm Stühle im Schnee. Dieser handelt von einer Kindesvergewaltigung und erzählt die Geschichte der Flucht eines jungen Mädchens in die Welt der Phantasie, um der Realität ihrer Entführung und Vergewaltigung zu entrinnen. Im Sommer 2008 stand Preuß für weitere Folgen der Serie Türkisch für Anfänger vor der Kamera.